一、研究背景
肝细胞生长因子(HGF)，也称为分散因子，是一种多效性细胞因子，它掌握着一种称为“侵入性生长”的特征性生物学程序。虽然HGF由间充质来源的细胞分泌，但其高亲和力受体Met酪氨酸激酶在广泛的组织中表达，包括上皮细胞、内皮细胞、造血细胞、肌肉细胞和神经元细胞。HGF/Met信号在胚胎发育过程中是必不可少的，在此期间，它驱动滋养层侵入子宫、发育器官中的新血管生成以及不同来源的分化前体细胞的迁移。
在成人中，HGF通路在正常条件下可能是沉默的，但它在需要器官结构重组的特定生物过程中恢复，包括组织再生和伤口愈合。HGF/Met信号传导是人类癌症中最常被激活的酪氨酸激酶途径之一。Met过表达通常导致对环境HGF的敏感性增加。
HGF防止细胞死亡和促进组织再生的能力使这种多效性细胞因子成为再生医学治疗用途的理想候选者。然而，Met受体在肿瘤生物学中的深入参与及其配体的促血管生成和促转移活性引起了对HGF治疗安全性的一些担忧。HGF的营养、有益作用与其促侵袭性、不利特性的分离是再生医学中一个备受争议的话题，也是利用其临床治愈潜力的关键点。
我们通过比较HGF与节拍因子1(MF-1)的治疗功效来解决这个问题，节拍因子1(MF-1)是一种衍生自HGF的工程细胞因子和HGF样因子巨噬细胞刺激蛋白(MSP)，在急性和慢性肝损伤。MF-1是Met的部分激动剂，在体外显示缺乏促侵袭活性。我们表明，虽然HGF和MF-1均能有效防止肝损伤并促进肝细胞再生，但只有HGF而不是MF-1，驱动肿瘤血管生成并显着增加癌细胞的转移潜力。
二、研究结果
Result1MetronFactor-1在原代肝细胞中的信号传导
MF-1，N结构域和MSP的两个第一三环和N域和HGF（图1A），在哺乳动物细胞中产生如上述材料和方法通过亲和纯化至均一色谱法（图1B）。由于MF-1与HGF受体(Met)和MSP受体(Ron)结合，我们确定了小鼠原代肝细胞中Met和Ron的表达。小鼠肝细胞系MLP用作阳性对照。免疫沉淀和蛋白质印迹使用抗Met和抗RON抗体表明，小鼠肝细胞表达两种受体（图1C）。通过免疫组织化学测定，人肝细胞也表达Ron。因此，肝脏是MF-1的潜在靶点。为了验证这一假设，我们用越来越高浓度的MF-1刺激小鼠原代肝细胞，用抗Met或抗Ron抗体免疫沉淀细胞提取物，并用抗磷酸酪氨酸抗体通过蛋白质印迹确定受体磷酸化。HGF和MSP用作对照。用抗-Met和抗-Ron抗体测定总受体水平。如前所示，33MF-1活化的Met和罗恩较少有效地用HGF或MSP，分别（图1D）。
接下来，我们确定了MF-1激活Met和Ron下游关键信号通路的能力。如所述刺激原代肝细胞，然后在不同时间裂解。使用抗磷酸化-ERK和抗磷酸化-AKT抗体通过蛋白质印迹分析细胞提取物。使用抗甘油醛3-磷酸脱氢酶抗体将总蛋白质量归一化。如图所示1E，所有因素引起的ERK和AKT途径的激活。然而，与HGF或MSP诱导的磷酸化相比，MF-1诱导的ERK和AKT磷酸化不那么迅速和明显。
Result2MetronFactor-1促进肝细胞增殖和存活
为测试MF-1是否促进肝细胞的生存，我们预孵育的原代细胞与不同浓度的MF-1，HGF，或MSP的，然后攻击细胞用抗Fas抗体或星形孢菌素。通过游离核小体法测定细胞死亡。值得注意的是，MF-1非常有效地保护肝细胞免于细胞凋亡，其程度即使不优于HGF（图2C、D)。MSP仅在低剂量下促进细胞存活，而较高浓度则无效。为了确定MF-1是否在原代肝细胞中引起生物效应，我们进行了有丝分裂试验，这是测试HGF活性的标准试验。将新鲜分离的细胞接种在涂有胶原蛋白的培养皿中，在无丝裂原培养基中孵育，然后用浓度增加的MF1、HGF或MSP进行刺激。如图2所示A，HGF和MF-1都对原代肝细胞有丝分裂作用，尽管——与我们对信号转导的分析一致——HGF比MF-1更有效。相比之下，MSP对DNA合成的影响很小。为了进一步表征MF-1对肝细胞的促有丝分裂作用，我们分析了因子刺激后细胞周期蛋白D1和CDK-4的水平。如所述刺激细胞并在不同时间点裂解。使用抗细胞周期蛋白D1和抗CDK-4抗体通过蛋白质印迹分析细胞提取物。使用抗-β-肌动蛋白抗体将总蛋白量标准化。该分析表明，MF-1刺激诱导这两个关键G1到S转换调节因子的表达。相比之下——与其无法促进DNA合成一致——MSP没有显着诱导细胞周期蛋白D1或CDK-4。
Result3MetronFactor-1不促进肿瘤细胞运动和侵袭
MetronFactor-1不促进肿瘤细胞运动和侵袭
MF-1对小鼠肝脏前体细胞缺乏促侵袭活性。33因为HGF临床使用的一个主要问题是其对癌细胞的促侵袭活性，我们测试了MF-1是否可以诱导几种肿瘤细胞系的侵袭。HepG2人肝癌细胞、A人肺癌细胞和MDA-MB-人黑色素瘤细胞，同时表达Met和Ron（图3A）。对于前一种分析，在紧密集落中生长的细胞用不同浓度的MF-1、HGF或MSP刺激。在这些实验中，MF-1没有引起细胞形态的任何显着变化，而HGF和MSP促进细胞散射的效率取决于细胞系（图3B)。对于基质胶侵袭试验，将细胞接种到Transwell板中的基质胶层上，然后用不同浓度的MF-1、HGF或MSP刺激。通过确定迁移通过基质胶层的细胞数量来量化入侵。同样在该测定中，MF-1对肿瘤细胞没有显示任何显着的促侵袭活性（图3C）。
由于缺乏促侵袭活性是MF-1潜在临床应用的核心，我们设计了进一步的实验，可以更彻底地表征这一生物学方面。首先，我们确定了MF-1是否会影响HGF和MSP促进侵袭的能力。为此，我们在不存在或存在MF-1的情况下用HGF或MSP刺激A细胞，并如所述测量它们侵入基质胶的能力。该分析表明MF-1有效地拮抗HGF诱导的基质胶侵袭（图3D）。这与HGF和MF-1竞争Met受体上相同的高亲和力结合位点的观点一致。33相比之下，MF-1基本上不影响MSP诱导的细胞迁移。46接下来，我们使用分别仅表达Met和Ron的LOC人上皮肾细胞和T47D人乳腺癌细胞进行了额外的基质胶侵袭试验。HGF和MSP是有效的时，他们的特异性受体是存在的，而MF-1没有在任一系统中促进侵袭。总之，这些数据表明，与HGF和MSP相比，MF-1不促进肿瘤细胞运动和侵袭，并且这种缺乏促侵袭活性与靶细胞上的Met或Ron表达无关。
Result4MetronFactor-1不诱导内皮细胞迁移和形态发生
显着促进肿瘤生长的HGF的一个关键生物学特征是其有效的促血管生成活性。38新血管生成取决于三个基本过程，所有这些过程都必须被适当诱导以实现新血管的形成：内皮细胞迁移、内皮细胞增殖和细胞外基质重塑。47为了确定MF-1促进血管生成的能力，我们进行了三种不同的分析，使用HUVEC在体外重现了这些过程。通过蛋白质印迹分析确定内皮细胞表达Met和Ron（图3）。在使用纤连蛋白包被的Transwell过滤器的迁移测定中，HGF和MSP促进内皮细胞迁移通过纤连蛋白层，而MF-1完全无效（图4A）。相比之下，与用肝细胞获得的结果一致，MF-1诱导HUVECs的有丝分裂，通过溴脱氧尿苷掺入测量（图4B）。最后，在测量内皮细胞侵入细胞外基质能力的伪足伸长试验中，HGF和MSP促进了伪足生长，而MF-1完全失活（图4C）。因此，MF-1仅具有HGF显示的三种关键促血管生成活性中的一种，至少在体外是这样。
Result5MetronFactor-1体外和体内稳定性
我们接下来着手研究MF-1作为药物的适用性。为了能够在体外和体内量化MF-1浓度，我们开发了特定的多克隆抗MF-1抗体，如材料和方法中所述。为了确定MF-1的稳定性，我们将重组MF-1溶解在用于HGF递送23的标准载体缓冲液中，浓度为50ng/mL。蛋白溶液在37°C下孵育数天，并在不同时间通过ELISA测定其浓度。如图5所示A，重组MF-1在这些条件下非常稳定，因为90%以上的蛋白质在孵育6天后仍然存在。
接下来，在体内测试了MF-1的稳定性。将所述蛋白质制剂静脉注射到成年雄性Balb-c小鼠（10μgMF-1/小鼠）中，并在不同时间（1、2、4、12和24小时）从注射的小鼠中收集血液样本。MF-1浓度在血浆通过ELISA（图测量5B）。值得注意的是，该分析表明，MF-1在血浆中的半衰期约为1小时，该值明显高于重组HGF报道的值（2.4分钟48）。在任何情况下，这些数据表明静脉注射可能不是最适合MF-1递送的方法，因为需要非常频繁地重复注射蛋白质以达到恒定的血浆药物浓度。
为了克服这个问题，我们采用了专为重组蛋白输送设计的微渗泵。小鼠腹膜内植入渗透泵，设置为每天释放20μg重组因子。从手术当天开始，定期（12、24、48、72和96小时）采集血样，并通过ELISA测定血浆中的MF-1浓度，如所讨论的。如图所示5C，等离子体MF-1浓度在这些动物保持从基本恒定的，早在植入后12小时，用14±2.3纳克/毫升的总平均。考虑到内源性HGF以大约0.5ng/mL的浓度存在于小鼠血浆中，从生物学角度来看，这些水平可能具有重要意义。
Result6MetronFactor-1可防止CCl4引起的小鼠急性肝损伤
使用所描述的渗透泵介导的递送方法，我们接下来比较了MF-1和HGF在体内的生物活性。由于MSP不具有促有丝分裂作用，仅对肝细胞显示出微弱的抗凋亡作用，但仍能强烈促进肿瘤和内皮细胞的运动和侵袭，因此我们将其排除在进一步研究之外。如所述，将五组雄性Balb-c小鼠（五只小鼠/组）腹膜内植入渗透泵。携带空渗透泵的小鼠用作对照。一天操作之后，将小鼠与CCl的亲脂性溶液皮下注射4诱发急性肝损伤。在不同的时间检查每组小鼠。就在抑制之前，从每只动物中采集血样并分析血浆中的ALT含量（图6A）。尸检，肝收集并用于组织学分析（图6B）。
该分析表明，MF-1在预防急性实验性肝损伤和促进肝再生方面至少与HGF一样有效。急性中毒12小时后，发现对照小鼠的ALT水平增加了多倍。MF-1阻止了这种增加72%和HGF阻止了67%。CCl4给药一天后，对照小鼠的肝脏在中央静脉周围显示出广泛的坏死。在用MF-1或HGF治疗的小鼠中，中央静脉周围带状坏死的扩展显着减少。控制肝脏切片包含大量TUNEL阳性凋亡细胞。与对照组相比，MF-1和HGF处理小鼠的肝脏切片中的凋亡细胞分别减少了49.6%和50.7%。在第2天，对照组中很少有肝细胞对phospho-histone-3（M期标志物）呈阳性，表明这些动物的肝再生尚未开始。相比之下，MF-1和HGF组的肝脏切片每个区域包含5.50±1.64和8.17±2.23磷酸组蛋白3阳性细胞，揭示了更高的肝细胞分裂率。
Result7MetronFactor-1可改善CCl4诱导的肝纤维化
这些数据表明MF-1是急性肝衰竭模型中的一种有效的肝营养因子。为了进一步探索其治疗潜力，我们测试了其预防或治疗与慢性肝中毒相关的肝纤维化的能力。成年雄性C57BL/6J小鼠每两周一次皮下注射一次CCl周。在第6周，将小鼠腹膜内植入含有MF-1或HGF的微渗泵，如所述。泵每周更换一次。植入仅含载体的渗透泵的小鼠用作阴性对照。在第10周，从每只小鼠身上采集血液样本并分析血浆中的ALT水平。与急性模型相反，长期中毒的对照小鼠的血浆ALT浓度仅比正常未治疗小鼠高约2倍。然而，值得注意的是，MF-1和HGF几乎完全阻止了酶活性的这种增加（图7A）。
尸检时，提取肝脏并进行组织学处理。纤维化组织得到强调由天狼星红染色（图7B）和α-平滑肌肌动蛋白的免疫染色。在对照肝脏中，中央静脉周围清晰可见纤维化区域，一些纤维延伸到其他中央或门静脉。在MF-1处理和HGF处理的小鼠中，纤维化区域的强度和长度均出现显着减少。最后，我们通过Ki67表达的免疫化学分析确定了肝细胞增殖。增殖指数（图7C)对照小鼠肝脏中的含量非常低。在用HGF处理的小鼠中，增殖指数增加约2倍，MF-1实现了类似的效果。因此，同样在慢性纤维化模型中，MF-1显示出与HGF显示的那些相当的保护和愈合特性。
Result8MetronFactor-1不促进肿瘤生长和转移
为了比较MF-1和HGF的治疗安全性，我们分析了它们在癌症实验小鼠模型中促进肿瘤生长和转移的能力。为此，我们采用了一种基于慢病毒载体的离体方法，可以确定给定重组蛋白对肿瘤及其微环境的影响。38我们设计了编码MF-1或HGF的转基因慢病毒载体，然后使用这些病毒转导两种不同的表达Met和Ron的肿瘤细胞系。将等量表达MF-1或HGF的细胞皮下注射到CD-1nu-/-小鼠中，并监测动物的肿瘤发展。用空慢病毒载体转导的细胞用作对照。大约8周后，提取实验性肿瘤进行分析，并将肺部与印度墨水进行对比以突出转移。转移评分后，对肺进行处理以进行组织学分析。
这些实验证实，HGF有效地促进在两种细胞系统异种移植物生长38，41（图8A）。尸检时，表达HGF的肿瘤比对照肿瘤大约5.9倍和2.3倍。相比之下，表达MF-1的肿瘤仅略大于对照，并且这些差异无统计学意义（两种情况P0.05）。与我们的体外一致分析，免疫荧光用抗CD31抗体的肿瘤切片的染色显示，HGF但不MF-1促进肿瘤血管生成（图8B）。HGF使A肿瘤的微血管密度增加了4.6倍，而MF-1基本上没有影响。类似的结果在MDA-MB-肿瘤（图8C）。
在立体显微镜下对肺转移进行评分。该分析表明，肿瘤中的HGF表达增加了两种细胞系统中的转移发生率。在对照动物中，六只小鼠中只有两只(MDA)或一只(A)有可见的转移。在HGF组中，几乎所有动物都受到转移性病变的影响。相比之下，MF-1表达对任一模型中的转移发生率没有实质性影响。HGF表达还增加了每只小鼠的平均转移数，而MF-1基本上没有影响（图8D)。用苏木精-伊红染色的连续肺切片的组织学分析证实了这些结果。在对照动物和MF-1组中，转移细胞非常罕见，仅在那些在立体显微镜下鉴定为阳性的肺中发现。相反，来自HGF的小鼠肺中的小转移病灶内长满，其中大多数的栓塞型的（图8E）。
Result9MetronFactor-1可防止CCl4引起的小鼠急性肝损伤
我们采用了一种类似的、基于慢病毒载体的方法来确定HGF和MF-1对癌细胞肝内传播的影响。鼠标CBO--C12肝癌细胞36与慢病毒载体编码HGF，MF-1，或不因子作为对照，和因子分泌到培养基中。将等量（0.75×个细胞/小鼠）的慢病毒载体转导细胞原位注射到CD-1nu-/-的左肝叶中小鼠通过单个注射部位。1个月后，动物被抑制并通过立体显微镜分析肝脏。肿瘤块被鉴定为与深红色背景明显不同的白色结。大多数肝脏在注射部位含有原发肿瘤；该HGF组的肝脏含有最大肿瘤（图9B）。除了原发部位，从肝内肿瘤细胞传播衍生小，次级集落可与HGF表达细胞注射的小鼠被识别，而不是在控制或在动物中注射细胞中表达MF-1（图9C）。在HGF组的一些动物中也可以发现几个大的肝外转移瘤，通常附着在腹膜内壁上（图9）D)，表明HGF（而非MF-1）显着增强了CBO--C12肝癌细胞的转移潜能。
显微镜分析后，对肝脏进行处理并通过组织学进行分析。这使得可以确定在对照和MF-1动物的注射部位发生的原发性肿瘤主要位于内脏粘膜下方，因此非常浅表和以外来体典型的非坏死性巨细胞炎症反应为特征(图9E)。相比之下，表达HGF的病变是深的、侵袭性的、富含有丝分裂，并且容易引起栓塞转移。肿瘤细胞栓子的播散常常引起健康肝细胞的继发性缺血（图9F）。只有一个在单个动物转移灶的MF-1组中被发现，并且这结节几乎没有坏死，差有丝分裂，且富含砂粒体，从而拉开了低增殖速率和活性回归过程（图9G）。总而言之，我们的肿瘤发生实验表明HGF表达促进肿瘤生长，驱动肿瘤血管生成，并促进癌细胞的转移性传播。相比之下，在相同的系统中，类似水平的MF-1具有基本中性的影响。
三、总结与思考
本研究中的结果表明，MF-1是一种衍生自HGF和HGF样因子MSP的工程因子，可预防或减轻急性和慢性肝损伤小鼠模型中的肝损伤并促进肝细胞再生。他们还表明，与HGF相比，MF-1不会引发通常由完全Met激活诱导的侵袭性生长程序，这会导致肿瘤侵袭、血管生成和转移，如通过几种体外侵袭试验和三种不同的小鼠模型所测量的的癌症。
因此，Met和Ron的部分激活似乎足以保护细胞免于细胞凋亡和促进组织再生，但不足以诱导侵入性生长。从治疗的角度来看，这个概念是“好消息”，特别是对于再生医学。基于这个想法，将有可能设计出“智能”治疗剂——其中MF-1是原型——只在达到治疗效果所需的程度上激活Met和Ron，从而降低促进作用的风险。将肿瘤进展降至最低。
总之，基于此处提供的数据，我们建议MF-1是HGF的更安全有效的替代品，可用于临床治疗或预防肝病或其他对HGF治疗有反应的疾病。
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策划/殷佩浩
审校/殷佩浩
翻译/汪玉倩
责任编辑/汪玉倩
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