研究背景
在美国与欧洲，对乙酰氨基酚（APAP）过量是药物导致急性肝衰竭（ALF）的主要原因。APAP致毒机制在于其肝脏代谢产物N-乙酰基-对-苯醌亚胺（NAPQI）可以引起肝细胞坏死。高迁移率族蛋白1（HMGB1）是一个DNA结合蛋白，能够调节转录过程，在细胞坏死时释放出核；在胞外，HMGB1是一种损伤相关分子模式（DAMP）蛋白，作为促炎分子，通过与晚期糖基化终产物受体（RAGE）结合驱动中性粒细胞，介导炎症细胞向损伤部位的迁移与活化，激活无菌性炎症并放大肝损伤。许多DAMP蛋白，包括HMGB1，都是HS结合蛋白。
硫酸乙酰肝素（HS）是一种在细胞表面及胞外基质中富集的硫酸多糖。在体内HS主要以HS蛋白聚糖的形式存在，包含一个核心蛋白和HS多糖。多配体聚糖Syndecans，包括syndecan-1、syndecan-2、syndecan-3和syndecan-4，都是细胞表面常见的HS蛋白聚糖。HS蛋白聚糖参与炎症的各个方面，包括趋化因子呈递和中性粒细胞跨内皮迁移。HS蛋白聚糖的功能主要依靠其HS多糖侧链，由与携带磺酸基的氨基葡萄糖(GlcN)残基相连的葡萄糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA)的双糖重复单位组成。HS的链长和硫化模式决定其生物学功能。
本文研究中，作者利用化学酶法合成了HS十八糖（18-mer-HP或保肝18-mer），证明在APAP诱导的ALF小鼠模型中18-mer-HP通过抑制HMGB1/RAGE轴的促炎活性来发挥保肝作用，揭示了以碳水化合物为基础的化合物可以控制由APAP过量引起的ALF。
研究结果
1、利用化学酶法合成均质性18-mer-HP
天然来源的HS是高度复杂的混合物，具有不同的多糖链长和硫酸化模式。结构均一的HS低聚糖，特别是与内源性全长的HS具有相似功能的长链HS低聚糖的缺乏，阻碍了HS作为治疗药物的应用。本文作者利用之前开发的一种高度有效的化学酶合成法，合成了HS低聚糖18-mer-HP（图1A），是目前合成的最长的HS低聚糖之一。经MS和NMR确定其机构为GlcNS-GlcA-GlcNS-(IdoA2S-GlcNS)7-GlcA-pNP。经高分辨率阴离子交换高效液相色谱法确定纯度98％。
2、18-mer-HP对APAP所致肝损伤的保护作用
作者建立了APAP诱导ALF小鼠模型来研究18-mer-HP的保肝作用（图1B）。与APAP模型组相比，经18-mer-HP治疗后，小鼠血浆中丙氨酸氨基转移酶（ALT，肝脏损伤的生物标志物）的浓度显著下降（图1C），提示其肝保护作用。18-mer-HP治疗还降低了血浆中组织坏死因子TNF-a的浓度（图1D），提示其缓解局部和全身性炎症的作用。此外，肝脏HE染色及中性粒细胞免疫组化分析表明18-mer-HP减少了坏死肝面积和中性粒细胞浸润（图1F），进一步验证其抑制炎症的保肝作用。
在实验过程中，APAP模型组与18-mer-HP治疗组的肝谷胱甘肽（GSH）的浓度变化基本一样（图1E）。GSH的浓度一般随着NAPQI的形成而降低。因此表明，18-mer-HP不影响APAP向细胞毒性中间体NAPQI的代谢转化。
综上结果表明18-mer-HP通过减少炎症反应而非影响APAP代谢来改善肝脏损伤。
3、18-mer-HP靶向HMGB1/RAGE轴来缓解炎症
HMGB1近期被证明是APAP毒性动物模型中的一个重要的调节因子，因此本文探讨了18-mer-HP的肝保护作用是否靶向HMGB1。小鼠气囊炎症模型中，重组HMGB1引起大量的中性粒细胞浸润，而18-mer-HP治疗后则显著减少（图2A）。因此18-mer-HP减少了HMGB1介导的中性粒细胞浸润。APAP诱导的肝损伤小鼠模型中，18-mer-HP和α-HMGB1（HMGB1中和抗体，能保护APAP过量导致的肝损伤）发挥同样的肝脏保护效果（图2B和2C），且二者联用并未提高疗效，提示18-mer-HP和α-HMGB1通过靶向相同的生物过程发挥保肝作用。
RAGE缺乏小鼠（Ager?/?）及野生WT小鼠的APAP肝损伤实验中，18-mer-HP不能降低Ager?/?小鼠体内的ALT浓度（图2D）和中性粒细胞浸润（图2E），且与WT小鼠相比，Ager?/?小鼠对APAP过量的炎症反应明显下降，提示18-mer-HP的肝保护作用依赖于RAGE的存在，证明18-mer-HP靶向HMGB1/RAGE轴。此外，对WT和Ager?/?小鼠进行APAP（mg/kg，致死剂量）致死率实验，发现给予APAP96h后，18-mer-HP可以提高WT小鼠的生存率，从50%升至90%，而Ager?/?小鼠的生存率在未经治疗时就已高达86%（图2F）。这一发现与文献一致，表明APAP过量导致的肝损伤通过HMGB1/RAGE轴放大恶化。
综上表明18-mer-HP通过靶向HMGB1/RAGE轴来缓解炎症，发挥保肝作用。
4、与HMGB1的结合和肝保护依赖于HS低聚糖的长度
为了探讨HS低聚糖与HMGB1的构效关系，作者合成了不同链长的寡糖，但保留了相同的2-磺基-艾杜糖醛酸（IdoA2S）和N-磺基-葡糖胺（GlcNS）二糖重复单元，即12-mer和6-mer（图3A）。
利用生物素化的HS低聚糖进行小鼠肝裂解液的pull-down实验，只有18-mer-HP成功将HMGB1结合下来（图3B）。同样，在APAP过量模型中18-mer-HP从小鼠血浆中拉下了循环的HMGB1（图3C）。HMGB1竞争性结合实验表明，18-mer-HP能够与35S标记的HS竞争性地结合HMGB1，IC50为nM，而6-mer即使在nM时也不与HMGB1结合（图3D）。此外，将APAP过量小鼠的肝脏组织切片与HS低聚糖或PBS孵育后再进行HMGB1免疫组化染色（图3E），结果显示，在细胞核和细胞外HMGB1染色明显，10μM和μM的18-mer-HP孵育后HMGB1染色减少，而6-mer没有影响，表明18-mer-HP可以在肝损伤部位与HMGB1结合。
同时，作者也利用小鼠APAP肝损伤模型来检测这三种HS低聚糖的肝保护作用。结果显示，只有18-mer-HP能够降低APAP过量引起的血浆高ALT浓度和肝脏的中性粒细胞浸润（图3F和3G）。6-mer和12-mer没有肝保护作用，这与其不与HMGB1结合的结果一致。
综上结果表明，链长大于12个糖基的HS低聚糖才能与HMGB1结合并发挥肝保护作用。
5、抗凝剂18-mer-AXa不显示肝保护作用
肝素作为一种抗凝剂，是HS的类似物。为了检测抗凝活性对肝保护作用的影响，作者合成了另一种十八糖，18-mer-AXa。与18-mer-HP相比，18-mer-AXa结构中具有额外的3-O-和6-O-磺基（图4A）。在小鼠体内，只有18-mer-AXa降低了血浆中的凝血因子Xa（FXa）的活性，证明18-mer-AXa具有抗凝活性（图4B）。与18-mer-HP一样，pull-down实验证明18-mer-Axa也能够将HMGB1从肝裂解液中结合下来（图4C)。
尽管18-mer-AXa与HMGB1具有较高结合力，但在APAP过量小鼠模型中并未显示肝保护作用（图5A和B）。通过检测Ki67阳性细胞进行肝脏再生功能评价（图5C），结果显示在APAP过量小鼠体内，Ki67阳性细胞数升高，在72h达到峰值，随后在h降至基线水平；18-mer-HP用药后Ki67阳性细胞数变化趋势与模型组相似，但是由于肝损伤减少，其上升幅度较小；而18-mer-AXa用药后Ki67阳性细胞并未增多，表明18-mer-AXa治疗后小鼠肝再生过程可能受到损害。文献表明小鼠过量摄入APAP后，需要纤维蛋白（原）来启动肝再生。因此，作者检测了小鼠肝脏中纤维蛋白（原）沉积量，结果发现与APAP模型组相比，18-mer-AXa组小鼠肝脏中纤维蛋白（原）沉积量明显较低（图5D），表明了18-mer-AXa给药后损伤部位纤维蛋白积聚减少导致肝再生功能缺失。
因此综上所述，具有抗凝活性的18-mer-AXa并不具备肝保护作用，反而影响肝再生过程。
6、在APAP摄入过量后内源性syndecan-1从细胞表面脱落
Syndecan-1，肝细胞表面最常见的HS蛋白多糖，由一个带有HS侧链的核心蛋白组成。病理条件下在基质金属蛋白酶的作用下从细胞表面脱落。最近的研究表明，syndecan-1-/-小鼠对APAP毒性引起的肝损伤高度敏感。另外，研究还表明，纯化的syndecan-1和HS多糖，而不是syndecan-1的核心蛋白，在APAP过量后对syndecan-1-/-小鼠具有保护作用，且syndecan-1在APAP过量的WT小鼠中也显示出保护作用。但并未发现HMGB1与syndecan-1的结合。
本文研究表明，小鼠摄入过量APAP后，血浆中胞外游离的syndecan-1在3h内迅速增加，与HMGB1血浆浓度升高趋势一致；18-mer-HP则减少了syndecan-1的脱落和HMGB1血浆浓度（图6A）。同时，在APAP过量导致的ALF（APAP-ALF）临床病人的血浆中也检测到syndecan-1浓度升高（图6B）。
为了确定syndecan-1是否直接通过HS侧链与HMGB1结合，利用免疫共沉淀法分析发现，与18-mer-HP一样，纯化的syndecan-1能够与35S-HS竞争性地结合HMGB1，并呈剂量依赖性（图6C）。而缺少HS多糖侧链的syndecan-1核心蛋白则不能与HMGB1结合。这些结果表明脱落的syndecan-1通过HS侧链与HMGB1结合。此外，免疫共沉淀分析还表明syndecan-1和18-mer-HP竞争性结合HMGB1的IC50分别为-nM和nM，表明两者与HMGB1具有相似的亲和力。
已有研究表明用佛波酯（PMA）处理Hep3B细胞会导致syndecan-1的脱落。因此作者利用人肝癌细胞系Hep3B研究了细胞表面syndecan-1的脱落过程对HMGB1结合的影响。结果表明，经PMA处理后，~85%的syndecan-1从肝细胞表面脱落下来，且HMGB1结合到细胞表面的数目减少（图6D）。
因此结果表明肝细胞表面脱落的syndecan-1可以与HMGB1结合，抑制HMGB1结合到肝细胞。
7、18-mer-HP的延迟治疗具有肝保护作用
N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一种NAPQI中和抗氧化剂，是APAP过量的治疗标准药物。然而患者摄入APAP后只有在8小时内给予NAC治疗才有效。由于无菌炎症发生在NAPQI引起的细胞损伤之后，因此作者研究了APAP中毒后18-mer-HP延迟治疗的可能性。在给予小鼠亚致死剂量的APAP（mg/kg）后，在3、6或9小时用18-mer-HP进行治疗，观察其延迟治疗效果，并以NAC作为阳性对照（图7A）。ALT检测结果表明，APAP摄入后3h和6h，NAC失去了肝保护作用，而18-mer-HP仍然能够降低ALT浓度，在9h时无作用（图7B）。
同时作者给予小鼠致死剂量的APAP（mg/kg）并观察用18-mer-HP或NAC进行3和6小时延迟治疗的生存率，结果表明，APAP摄入后延迟3h给予18-mer-HP治疗具有完全的保护作用，小鼠未出现死亡，而NAC没有效果（图7C）。18-mer-HP也在延迟6h时失去疗效（图7D）。
综上表明，18-mer-HP具有比NAC更宽的治疗窗，对治疗晚期APAP摄入过量患者具有潜在的优势。
讨论与结论
已有研究表明，异质性肝素衍生物可保护小鼠免受ALF损伤，但其机制尚不清楚。使用均质低聚糖可以提高与HMGB1结合的选择性，同时消除非靶向效应。人源化HMGB1中和抗体已成功用于治疗APAP诱导的小鼠肝损伤；一些小分子HMGB1抑制剂也具有保护作用，但其疗效还有待确证。因此必须寻找一种特异的安全有效的抑制剂消除HMGB1的促炎活性。本文作者发现了一种HS十八糖18-mer-HP，通过靶向HMGB1/RAGE轴消除无菌性炎症，发挥有效的保肝作用。
本文亮点在于，syndecan-1的脱落与HMGB1的释放之间的关系揭露了APAP过量后人类和小鼠体内的内源性保护途径。另外在大面积肝损伤时，脱落的syndecan-1可能不足以中和所有的HMGB1，18-mer-HP的治疗能够提供进一步的肝脏保护，因此推测18-mer-HP增强了syndecan-1介导的宿主抗炎作用。但目前尚缺乏体内模型直接证明脱落syndecan-1通过HMGB1/RAGE发挥肝保护作用。本研究还为晚期APAP过量患者提供了一种潜在的治疗方法，当肝脏损伤低于一定阈值时，给予18-mer-HP可以达到充分的保护效果，但其有效延迟治疗的时间框架仍有待确定。本文还利用化学酶法为均质性低聚糖的合成大大降低了成本，有助于其扩大生产规模。由于HMGB1与多种疾病有关，包括癌症、中风、关节炎和败血症，基于HS的疗法作为HMGB1的抑制剂值得进一步研究。
读者思考：本文除了进行18-mer-HP作用及机制研究，还讨论了HS低聚糖抗凝活性、链长以及syndecan-1与HMGB1的结合力以及保肝作用的关系，但是是否具有抗凝活性就没有肝保护作用？链长12~18个糖基甚至以上的构效关系如何？进行syndecan-1脱落实验时为何选择人肝癌细胞Hep3B？可否用人正常肝细胞进行造模？18-mer-HP与HMGB1直接结合的证据不足，是否可以直接进行HMGB1敲低或敲除？最好能得到18-mer-HP与HMGB1蛋白的共结晶进一步阐明其直接结合及机制，后续或还可就HS低聚糖的硫化模式进行构效关系研究。
本文于年3月18日发表于科学转化医学（ScienceTranslationalMedicine）杂志，第一作者是KatelynArnold，通讯作者为JianLiu和DingXu，DivisionofChemicalBiologyandMedicinalChemistry,EshelmanSchoolofPharmacy,UniversityofNorthCarolina和DepartmentofOralBiology,SchoolofDentalMedicine,StateUniversityofNewYorkatBuffalo为共通讯单位。
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